Pomocí “homology-directed repair” byly vytvořeny knock-out mutanty mechu Physcomitrium patens s nefunkční telomerázovou RNA (tr). V pilotním experimentu byly selektovány linie schopné dlouhodobého přežívání, které vykazovaly známky aktivace alternativního, tj. na enzymu telomeráze nezávislého prodlužování telomer (ALT). Analýza délek telomer v těchto liniích ukázala výrazné změny v délce a charakteru telomerově specifického hybridizačního signálu.
V rámci diplomové práce provede studentka analýzu délek telomer v dalších generacích rt mutantů. Analyzovat bude jak celkovou délku telomer metodou TRF (terminal restriction fragments), tak telomery na vybraných ramenech chromozomů (metoda PETRA, primer extension telomere repeat amplification). Dále bude studovat vlastnosti ALT telomerového chromatinu, konkrétně přítomnost jednovláknových 3' přesahů (in gel hybridizace) a strukturu chromatinu (přístupnost pro štěpení enzymem MNase). Studentka se dále pokusí o rekonstituci aktivní telomerázy v mutantních liniích, tj. opětovné vnesení kazety s genem kódujícím TR do tr mutantů.
Výsledky získané během řešení této diplomové práce budou součástí projektu, který se snaží o pochopení mechanismů umožňujících stabilizaci konců chromozomů pro dlouhodobé přežívání rostlin bez aktivního enzymu telomerázy.
 
Literatura:
Fajkus P et al. Evolution of plant telomerase RNAs: Farther to the past, deeper to the roots. Nucleic Acids Res 2021, 49, 7680-7694.
Goffová I et al. Roles of RAD51 and RTEL in telomere and rDNA stability in Physcomitrella patens. Plant J 2019, 98, 1090-1105.
Fojtová M et al. Telomere length dynamics in Physcomitrella patens. Plant Mol Biol 2015, 87, 591-601.
Fojtová M et al. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol 2015, 5, e1671.
Lang D et al. The Physcomitrella patens chromosome scale assembly reveals moss genome structure and evolution. Plant J 2018, 93, 515–533.