Biochemické metody studia diverzity

Komerční systémy pro identifikaci bakterií

Jedním ze základních biochemických přístupů k identifikaci mikroorganismů a z toho se odvíjejícího studia biodiverzity je zjišťování přítomnosti různých metabolických drah nebo vybraných enzymů u testovaných mikroorganismů, případně celých mikrobiálních komunit. Mikroorganismy jsou v tomto případě kultivovány za přítomnosti různých zdrojů uhlíku (sacharidy, bílkoviny či další látky). V případě, že je předložená látka metabolizována, její degradace je spojena s barevnou změnou přítomného indikátoru. Tyto testy byly většinou původně vyvinuty pro určování lékařsky významných bakterií. Jejich jednodušší variantou je například ENTEROtest 16 nebo 24 (Pliva Lachema) určený pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae.

Komplexní systém pro identifikaci mikroorganismů představuje systém Biolog (Biolog, Inc., USA) na mikrotitračních destičkách. Podle firemních údajů je schopný identifikovat více jak 2500 druhů aerobních a anaerobních bakterií, kvasinek a hub. Na mikrotitračních destičkách jsou v 95 jamkách testovány různé zdroje uhlíku, dusíku, fosforu a síry (případně i schopnosti využívat/vyžadovat i komplikovanější peptidové zdroje dusíku), dále vhodnost různých osmotických podmínek i vlivy pH a identifikace je založena na výměně elektronů uvolněných během respirace, což vede k změně barvy přítomného tetrazolia. Původně šlo o identifikaci kultivovatelných bakterií, protože testovanou bakterii je nutné nejprve nakultivovat a poté inokulovat do všech 96 jamek destičky. Nicméně již počátkem 90. let se objevila snaha o využití této techniky pro získání informací (ve formě fingerprintů) o složení celých mikrobiálních společenstvech (nebo přesněji o jejich metabolickém potenciálu), kdy byly destičky místo čistou kulturou jednoho mikroorganismu inokulovány mikrobiální frakcí izolovanou z environmentálního vzorku (Garland a Mills, 1991). Dnes je vedle destiček pro Gram-pozitivní bakterie, Gram-negativní bakterie, houby a kvasinky možné využít i tzv. EcoPlate, určené speciálně pro analýzu mikrobiálních komunit (Microbial Community Analysis). V tomto případě místo 95 různých substrátů obsahuje destička pouze 31 substrátů ve třech opakováních, což umožňuje i statistickou analýzu výsledků. Výsledkem je pak tzv. fyziologický nebo metabolický fingerprint-profil daného mikrobiálního společenstva. (např. Kirk et al., 2004).

Podobný systému BIOLOG je API systém (Merieux, France) nabízející řadu API proužků s různými zdroji uhlíku, které mohou být použity k měření funkční diverzity mikrobů i mikrobiálních společenstev (Torsvik et al., 1990b)

Využitím techniky BIOLOG a podobných systémů je generováno velké množství dat o fyziologických schopnostech daného společenstva s relativně jednoduchým technickým zázemím. Pomocí těchto výsledků můžeme odlišit různá mikrobiální společenstva, případně můžeme sledovat vývoj uvnitř jednoho společenstva. Nicméně i tento systém má svá omezení – získané údaje charakterizují pouze tu část mikrobiální komunity, která je schopná za daných podmínek růst (zároveň však lze spekulovat o tom, že pomocí tohoto systému lze do jisté míry získat údaje i o tzv. nekultivovatelných organismech – jejich podíl na fyziologickém profilu společenstva nelze alespoň zcela vyloučit), preferuje rychle rostoucí mikroorganismy, je citlivý k hustotě použitého inokula a odráží spíš potenciální než skutečnou metabolickou aktivitu daného společenstva (Kirk et al., 2004).

Využití biomarkerů ke studiu biodiverzity

Další možností studia diverzity mikrobiálních komunit je analýza vhodného biomarkeru, například lipidového profilu organismu nebo společenstva. Lipidy se v buňce vyskytují jako zásobní látky, specifické mediátory a aktivátory signálních procesů a především jako strukturní komponenty buňky – v cytoplasmatické membráně všech živých buněk (a vnější membráně buněčné stěny Gram negativních buněk), jejich složení se však liší od organismu k organismu, takže například druhy rodu Micrococcus lze rozlišit na základě profilů rozvětvených mononenasycených mastných kyselin. Stejně tak lze lipidový profil využít i k charakteristice struktury mikrobiálních komunit.

Jednou z často využívaných metod je analýza metylesterů mastných kyselin, tedy tzv. FAME analýza – fatty acid methyl ester analysis (Ibekwe a Kennedy, 1999). Principem metody je esterifikace mikrobiálních lipidů s následným nástřikem, separací a identifikací metylových esterů mastných kyselin na plynovém chromatografu. Jde o rychlou a ne příliš drahou metodu, avšak interpretace získaných dat není jednoduchá (mnoho mastných kyselin je společných pro více mikroorganismů). Tato metoda je používána jak pro identifikaci mikroorganismů (Sherlock Microbial Identification Systém zavedený v roce 1991 pro identifikaci více než 1500 mikrobiálních druhů), tak pro charakterizaci diverzity mikrobiálních společenstev.

Podobnou metodou je PLFA analýza (Ibekwe a Kennedy, 1998), tedy „phospholipid fatty-acids analysis“, která využívá mastné kyseliny specificky vázané k polární lipidové frakci a tím značně zvyšuje citlivost a specificitu detekce mikrobiálních populací. Metoda začíná extrakcí všech lipidů ze vzorku, které jsou pak frakcionovány na neutrální lipidy, glykolipidy a fosfolipidy. Oddělené fosfolipidy jsou pak dále metylovány a analyzovány na plynovém chromatografu. Analýza PLFA je zdlouhavější než výše uvedená metoda FAME, protože ale fosfolipidy jsou po smrti buněk rychle degradovány (v řádu minut, maximálně hodiny), předpokládá se, že extrahované lipidy reprezentují pouze živé buňky ve vzorku. Výše uvedená FAME metoda pracuje s lipidy i z mrtvé organické hmoty včetně zásobních lipidů, které jsou citlivější na růstové podmínky. Fosfolipidové větvené mastné kyseliny jsou specifické pro bakterie, eukaryotické organismy jsou charakterizovány poly-nenasycenými mastnými kyselinami. Kromě toho PLFA profil poskytuje informaci nejen o složení a relativní četnosti populací komunity, ale i o fyziologickém stavu těchto populací. Například hladovění či stres se projeví vyšším poměrem trans/cis izomerů mono-nenasycených PLFA, ve zvýšeném poměru nasycených k nenasyceným mastným kyselinám i zvýšeném poměru cyklopropyl mastných kyselin k jejich mono-nenasyceným prekurzorům. Celkovou citlivost metody je možné zvýšit spojením separace na plynovém chromatografu s hmotnostním spektrometrem (GC-MS). Metoda FAME ve srovnání s PLFA vyžaduje menší vzorek, na druhé straně však reprodukovatelnost výsledků je lepší u metody PLFA. Po taxonomické stránce metoda PLFA nezahrnuje Archea, protože ty mají mastné kyseliny vázané etherovou vazbou na rozdíl od esterové u bakterií (Palojarvi 2006).

Další metodou využívající buněčných lipidů je analýzy quinonového profilu společenstva. Quinony tvoří součást respiračního a fotosyntetického elektronového transportního systému mikroorganismů. Jako jedni z prvních je využili k taxonomickým účelům u koryneformních bakterií Collins et al. (1979). Jedná se o jednoduchou, rychlou a levnou metodu, kdy jsou quinony pomocí organických rozpouštědel extrahovány ze vzorku (např. Irvan 2006) a podrobeny analýze za využití nejrůznějších chromatografických metod (HPLC, tenkovrstevná či sloupcová chromatografie, hmotnostní spektrometrie). Výsledkem je opět určitý fingerprint zkoumaného společenstva. Ke studiu změn půdních mikrobiálních společenstev pod vlivem aplikace pesticidů je použili například Katayama et al. (2001), změny mikrobiálních populací během degradace lignocelulózového komplexu pomocí nich sledovali Huang et al. (2010).

Kromě FAME, PLFA a quinonové analýzy jsou k charakteristice mikrobiálních společenstev používány i mastné kyseliny lipopolysacharidů vnější membrány gram-negativních buněk. Tyto mastné kyseliny mohou být využity pro určení biomasy gram-negativních bakterií, nebo i struktury jejich společenstva (Parker et al., 1982). Podobně teichoové kyseliny gram-pozitivních bakterií byly použity k taxonomické klasifikaci (např. Tonn a Gander, 1979) i k určení biomasy těchto bakterií (Gehron et al., 1984). Muramová kyselina byla použita k určení biomasy bakterií a sinic (Balkwill et al., 1988), ergosterol k stanovení biomasy i růstu hub v půdě (např. Rousk a Bååth, 2011).

Stabilní izotopy a diverzita

Další zajímavé možnosti studia mikrobiální diverzity na pomezí mezi „biochemickými“ metodami a metodami využívajícími nukleové kyseliny poskytuje využití stabilních izotopů. Metody využívající přirozené frakcionace stabilních izotopů prvků mají již dlouholetou tradici. Možnosti jejich využití pro nejrůznější ekologické studie včetně archeologických aplikací shrnuli Peterson a Fry (1987). Kromě toho je možné využít stabilní izotopy i pro tzv. obohacovací studie. V tomto případě jde o aplikaci vhodného substrátu značeného stabilním izotopem některého prvku a následnou detekci tohoto izotopu ve fylogeneticky významných biomolekulách (PLFA, R/DNA) zkoumaného společenstva. V závislosti na druhu substrátu můžeme pak selektivně detekovat skupiny mikroorganismů schopné tento substrát využívat. Mluvíme zde o tzv. SIP metodách, tedy „stable izotope probing“. Jednou z prvních prací využívajících tuto metodu byla práce Boschker et al (1998), kteří aplikovali značený ¹³C acetát a ¹³C metan ke studiu redukce sulfátů spřažené s oxidací acetátů v sedimentech ústí řek a oxidace metanu ve sladkovodních sedimentech. Mikroorganismy zodpovědné za tyto procesy detekovali pomocí značených PLFA. O dva roky později použili značený ¹³CH₃OH nebo ¹³CH₄ Radajewski et al. (2000) opět ke studiu metylotrofních organismů, tentokrát však za využití DNA. Po inkubaci mikrokosmů s lesní půdou se značeným substrátem byla extrahována DNA a pomocí gradientové centrifugace rozdělena na normální lehkou frakci a značenou těžkou frakci. Ve frakci těžké DNA byly potom pomocí PCR, klonování a sekvenování stanoveni hlavní představitelé metylotrofních organismů podílející se na fixaci předloženého substrátu. Tato metoda umožňuje detekci aktivní části mikrobiálních společenstev, má však i četná úskalí. Její využití v prvé řadě předpokládá dostupnost vhodného značeného substrátu, který i v případě, že je komerčně vyráběn, bývá velmi drahý a k dosažení detekovatelného značení je třeba použít významná množství tohoto substrátu. Dále je třeba brát v úvahu fakt, že po využítí značeného substrátu cílovou skupinou mikroorganismů a (případném) zabudování značeného prvku do biomasy primárních konzumentů využívaného substrátu, může v potravním řetězci dojít k přenesení tohoto značení i do jiných mikroorganismů. Této vlastnosti se na druhé straně dá využít právě ke studiu zmíněných potravních řetězců.