AP-test (test acidifikační schopnosti)

Úvodní slovo

Jedním z faktorů ovlivňujících zásadním způsobem kvalitu konečného produktu při výrobě piva je fyziologický stav a metabolická kompetence násadních kvasinek. Viabilita (tj. životaschopnost, kterou lze vyjádřit jako poměr počtu živých buněk k jejich celkovému počtu v kultuře) a vitalita (fermentační a obecně metabolická schopnost buněk) kvasinek hrají při výrobě piva důležitou úlohu. Vitalita se snižuje u buněk stárnoucích či starých nebo buněk vystavených stresu. Nové druhy stresu mohou vznikat např. při zavádění moderních technologií (vysoký hydrostatický tlak v cylindrokónických tancích) nebo nových surovin.

Na stanovení viability a vitality kvasinek byla vyvinuta řada metod, které lze rozdělit na metody založené na vitálním barvení, stanovení reprodukční schopnosti buněk, měření obsahu důležitých látek, stanovení aktivity důležitých enzymů, stanovení metabolické rychlosti buněk, stanovení energetického stavu buněk. Tyto metody mají své výhody i omezení a optimální stanovení „kondice“ buněk násadních kvasinek jak během propagace, tak během fermentace a skladování, a především předpověď jejich chování během následujících fermentací zahrnuje současné použití několika technik. To vyžaduje pestré a často poměrně nákladné přístrojové vybavení.

AP-test se používá ke stanovení metabolické kompetence pivovarských kvasinek opakovaně nasazovaných v provozu, je založen na znalosti řady membránových pochodů probíhajících v kvasinkách metabolizujících endogenní i exogenní substráty. Hlavní pochod podílející se na acidifikační schopnosti kvasinek, tj. činnost H⁺-ATPázy, závisí nejen na stavu buněk (čerstvé buňky, buňky po skladování, praní atd.), ale velmi silně i na růstové fázi. Během diauxického přechodu a těsně po něm se aktivita H⁺-ATPázy u S. cerevisiae prudce snižuje a zůstává nízká během post-diauxické a stacionární fáze. To souvisí s přechodem buněk na energeticky úsporný režim, při němž je minimalizován provoz energeticky náročných pochodů zahrnujících vysokou spotřebu ATP.

Principem AP-testu je měření změny pH prostředí vyvolané kvasinkami. Při testu se 10 minut měří změna pH extracelulárního prostředí, poté se k suspenzi přidá glukóza a měří se dalších 10 minut. Po přidání cukru pH kvasničné suspenze výrazně klesne. Pokles pH je způsoben vznikem elektrochemického gradientu protonů přes plazmatickou membránu při absorpci živin. Gradient pH vytváří membránová ATPáza. Kromě ATPázy se na acidifikační schopnosti podílí i vylučování metabolických produktů, převážně slabých kyselin do prostředí. Při nedostatku metabolizovatelného cukru kvasinka pro udržení poměru extracelulárního a intracelulárního pH využívá energii zásobních polysacharidů, glykogenu a trehalózy. Za přítomnosti cukru v prostředí využívá kvasinka k udržení homeostáze jak endogenní, tak exogenní metabolizmus.

Změna pH v prvních 10 minutách po přidání kvasinek do vody (v nepřítomnosti vnějšího zdroje glukózy) se nazývá spontánní acidifikační schopnost, která vyjadřuje růstovou schopnost kvasinek a souvisí s obsahem zásobních polysacharidů v buňce.

Za 10 minut od přidání cukru do roztoku se měří další pokles pH. Glukózou indukovaná acidifikační schopnost značí aktivitu kvasinek při kvašení a rychlost glykolýzy. Základem reprodukovatelnosti výsledků je přesné měření pH a velmi dobrá kalibrace pH metru. Při dodržení nastavení pH metru neovlivní výsledky ani kolísání v navážce kvasnic o ± 11 %. Proto není nutné dodatečné stanovení sušiny.

Seznam přístrojů, materiálu a mikroorganizmů

Pomůcky a chemikálie

• destilovaná voda, centrifuga, pH metr, elektromagnetické míchadlo, roztok glukózy (50 %)

Mikroorganizmy

• Kvasnice: sušené lisované či vážené pekařské kvasnice, pivovarské kvasinky

Postup

Modifikace AP-testu dle Hollerové a kol., 2005

• Navážit 9 ±0,1 g pekařských kvasnic, přidat je do 50 ml vychlazené destilované vody a promýt.
• Centrifugovat suspenzi (3000 x g/10 minut), promýt. Opakovat 2×.
• Resuspendovat kvasnice v 50 ml destilované vody o pokojové teplotě.
• V tuto chvíli začíná měření pH (ponořit pH metr do roztoku) – čas 0 (pH₀).
• Vzorek míchat pomocí elektromagnetického míchadla.
• Po 10 minutách přidat 5 ml glukózy (50 % roztok) a zapsat hodnotu pH (pH₁₀).
• Odečíst hodnotu pH ve 20. minutě (pH₂₀).

Výpočet hodnoty AP

Veličina AP₁₀ odpovídá výsledku spontánní acidifikace před přidáním glukózy, vypočítá se z hodnoty pH v 10. minutě měření (pH₁₀):

kde 6,3 je hodnota pK systému CO₂/HCO₃^–, přibližně rovna vnitrobuněčnému pH.

Veličina AP₂₀ odpovídá výsledku glukózou indukované acidifikace. Vypočítá se z hodnoty pH ve 20. minutě (pH₂₀):

Výsledná hodnota AP₂₀ odráží fyziologický stav buněk:

Zhodnocení cvičení

Další informace k této problematice najdete v následující literatuře

Kontrolní otázky