Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou
Cíl cvičení
Získání řady ředění kultury mikroorganizmu. Stanovit počet životaschopných buněk.
Úvodní slovo
Pro stanovení počtu buněk ve vzorku se využívají přímé a nepřímé metody.
Mezi přímé metody patří stanovení počtu buněk pomocí mikroskopu, počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhodou je rychlost a stanovení počtu jak živých tak mrtvých buněk či jejich poměr, např. porovnáním poměru neobarvených živých buněk s počtem mrtvých, které se obarvují.
Mezi nepřímé metody patří metody kultivační. Kultivací části vzorku zjistíme počet životaschopných buněk, které vytvoří kolonie. Při některých fyziologických a genetických experimentech je nutné znát počet buněk ve vzorku. Počet buněk slouží jako standard pro porovnávání výsledků. Jednotkou výpočtu plotnové metody je počet životaschopných (na plotnách rostoucích) buněk v 1 ml média/vzorku, tzv. colony forming units - CFU/ml.
Plotnová metoda (kultivační nepřímá metoda) spočívá ve stanovení počtu narostlých kolonií za předpokladu, že každá buňka vytvoří jednu izolovanou kolonii. Plotnovou metodu lze provést dvěma způsoby, smícháním vzorku s tekutým temperovaným agarem nebo pipetováním vzorku na misku s agarem a rozetření L-kličkou (obr. 21).
Nefelometrické stanovení využívá intenzity světla odraženého od buněk, stanovení optické denzity suspenze buněk. Výhodou této metody je stanovení kalibrační křivky, počet buněk lze odečíst z lineární části křivky. Při ředění vzorku a pipetování buněk do ředícího roztoku je třeba dát pozor na rozbití buněk osmotickým šokem. Podle hustoty výchozí suspenze se určí počet zkumavek ředící řady. Pokud se očekává 0−103 CFU/ml, suspenze se jeví bez opalescence; při počtu 105 CFU/ml suspenze lehce opaleskuje; množství 107 až 109 CFU/ml vytváří mléčný zákal dle velikosti a tvaru buněk.
V protokolech bývá uvedeno, s jakým počtem buněk (CFU/ml) se pracovalo případně s jakým zákalem (%). Zákal je méně přesná hodnota, která slouží pro rychlou orientaci. Ve spektrofotometru lze měřit zákal média či ředícího roztoku, který obsahuje i mrtvé buňky. Pokud se při stejné metodě opakovaně pracuje za stejných podmínek se stejně starou kulturou, tedy i stejným zákalem, lze předpokládat přibližně stejný počet živých a mrtvých buněk. V rámci daného experimentu je při opakování metody hodnota extinkce víceméně konstantní.
Pro stanovení počtu buněk v různých prostředích je k dispozici řada metod, pro daný účel se volí metoda nejlépe vyhovující. Stanovení počtu mikroorganizmů se provádí v daném objemu a přepočítává se obvykle na 1 ml původního vzorku. Těmito výsledky jsou pak korigovány získané výsledky experimentů.
Stanovením počtu CFU/ml lze sledovat přírůstek buněk v čase. Pokud jsou během kultivace v tekutém médiu odebírány dobře promíchané vzorky, porovnáním počtu buněk v čase lze získat obraz o fyziologickém stavu kultury, o jejím prospívání či odumírání (účinky fyzikálních či chemických zásahů do rostoucí kultury, podpůrné či inhibující látky v potravinářství, v mikrobiálních technologiích atd.).
Grafickým vynesením hodnot CFU/ml odebíraných ze vzorku v tekutém médiu (bez dodávání živin) po stejných časových intervalech lze sestavit růstovou křivku mikroorganizmu v daném prostředí. Díky stanovení počtu buněk lze hodnotit podíly jednotlivých skupin bakterií smíšené kultury v jejich celkovém zastoupení. Lze porovnávat makroskopické znaky kultivovaných zástupců a pracovat na médiích základních i selektivních, případně selektivně diagnostických.
V praxi lze využít tzv. automatické počítače kolonií (obr. 22A) nebo stěrovou a výplachovou metodu pomocí analyzátoru (obr. 22B). Přístroj Lumitester PD (obr. 22B) dokáže rychle určit celkový stupeň kontaminace ovšem bez rozlišení druhů a rodů mikroorganizmů (měření luminiscence). Tento přístroj se využívá např. v potravinářských provozech.
Seznam přístrojů, materiálu a mikroorganizmů
Pomůcky a chemikálie
- Sterilní bakteriologické plotny s MPA
- Sterilní zkumavky, pipety, L-kličky
- Sterilní fosfátový pufr nebo fyziologický roztok
Mikroorganizmy
- Micrococcus luteus CCM 169
Postup
Ředění kultury
- Do sady sterilních zkumavek pipetovat po 0,9 ml sterilního fyziologického roztoku.
- Z dobře promíchaného vzorku s kulturou odebrat 0,1 ml suspenze a přenést do první zkumavky.
- Promíchat čistou špičkou obsah první zkumavky (celkový objem 1 ml), odebrat 0,1 ml a přenést do další zkumavky.
- Promíchat obsah druhé zkumavky a 0,1 ml přenést do třetí zkumavky. Takto pokračovat až na konec ředící řady (Obr. 23).
Očkování
- Popsat Petriho misky s MPA na víčko (kolonie se budou počítat tečkováním dna misky popisovačem).
- Ze zkumavek s ředěním 10−4 až 10−6 pipetovat 0,1 ml suspenze do misky. Pro každé ředění používat minimálně dvě misky, lépe tři, pro vytvoření průměru z ředění.
- Pipetovaný objem rozetřít sterilní L-kličkou krouživým pohybem po celém agaru, dnem misky otáčet proti pohybu roztírání, netlačit na L-kličku. Při pipetování a roztírání otevírat misky co nejméně. Vzorek rozetřít rovnoměrně, aby kolonie narostly izolovaně.
- Misky kultivovat dnem vzhůru 2−3 dny při 30 °C.
Kontrola sterility ředícího roztoku
- Ze zásobního fyziologického roztoku odebrat 0,1 ml, pipetovat na misku a rozetřít sterilní čistou L-kličkou. Kultivovat dnem vzhůru 2−3 dny při 30 °C.
Hodnocení
K hodnocení vybrat dvojici (trojici) misek vhodného ředění (obr. 24, misky se zhruba 20−200 koloniemi) a spočítat počet kolonií. Kolonie počítat ze dna misky a označit popisovačem na sklo tečkou. Ze získaných hodnot vypočítat průměr, číslo vynásobit kladnou hodnotou ředění a hodnotou 10 (na misku se nanášelo 0,1 ml, výsledek je přepočítaný na 1 ml). Získaný údaj je hodnota CFU/ml (colony forming units, počet bakterií schopných vytvořit kolonii/ml).
CFU/ml = průměrný počet kolonií · hodnota ředění (kladný exponent) · 10
Správný formát výsledku je např. 2,4·104 CFU/ml, nikoli 24·103 CFU/ml.
Zhodnocení cvičení
- Které ředění při odečítání výsledků (počtu kolonií) bylo nejvhodnější?
- Jaký byl počet (CFU/ml) buněk v původním vzorku? Probíhala práce asepticky? Pokud ne, proč?
- Byl zaznamenán velký rozdíl v počtu kolonií mezi miskami jednoho ředění (nesprávně promíchaný vzorek)?
- Došlo k nárůstu bakterií na kontrolních miskách s rozetřeným pufrem?
- Mohla kontaminace ovlivnit celkový počet CFU/ml, proč (morfotyp kolonií)?
- Byl vzorek dobře počitatelný (špatně rozetřený vzorek)?
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
- Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80−7262−341−9.
Kontrolní otázky
- Jaký je výpočet CFU/ml u plotnové metody, co znamenají jednotlivé členy vzorce?
- Plotnovou metodu jsme prováděli na neselektivním médiu a pracovali jsme s čistou kulturou. Kdy se využívá plotnová metoda na selektivních médiích?
- Pokud bychom při plotnové metodě místo kultury mikrokoka použili např. rybniční vodu. Stanovíme CFU/ml, jak a proč se bude lišit morfologie narostlých kolonií od nárůstu ředěné kultury mikrokoka? Budou kolonie rybniční vody také jediného morfologického typu?
- Podle čeho zvažujeme množství zkumavek s pufrem (délku ředící řady) plotnové metody, kdy stačí využít jednu či dvě zkumavky a kdy je potřeba mnohem vyššího počtu?
- Jaká jednotka se používá pro výpočet nárůstu při použití plotnové metody?
- Proč a jak se při plotnové metodě provádí kontrola ředícího roztoku?
- Co znamená zkratka CFU/ml a co vyjadřuje?
- Proč se při plotnové metodě neočkuje bakteriologickou kličkou?
- Vypočtěte CFU/ml, pokud byl stanoven počet kolonií 210 a 190 v ředění 10−6. Do 0,9 ml pufru v první zkumavce se pipetovalo 0,1 ml kultury.
- Popište podstatu plotnové metody.
- Jaký je rozdíl mezi přímým a nepřímým stanovením počtu buněk?
- Proč je nutno promíchat zásobní vzorek a dále dobře promíchávat obsah zkumavek ředící řady?
- Jak poznáme kontaminaci ředícího roztoku?
- Proč se na misku při plotnové metodě neroztírá např. 1 ml vzorku?
- Podle čeho odvodíte vhodný typ kultivačního média pro plotnovou metodu?