Úvod pro práci s mikroskopem

Úvodní slovo

Lupa vytváří přímý obraz zvětšený 10–15x. Lupa je dvojvypuklá či ploskovypuklá čočka. Předmět, který pozorujeme lupou, klademe do vzdálenosti menší, než je ohnisková vzdálenost. Slouží pro pozorování makroskopických znaků kolonií.

Mikroskop (obr. 7) se skládá z mechanické části (podstavec, stojan a stolek s křížovým posunem), osvětlovací části (zdroj světla, kondenzor, clona) a optické části (objektivy a okuláry). Objektiv je soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností, která vytváří skutečný převrácený obraz objektu, jež se promítá mezi ohnisko okuláru a okulár. Okulárem tento obraz pozorujeme jako pod lupou a vidíme neskutečný zvětšený obraz.

Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší, než jsou rozměry objektu. Rozlišujeme mikroskopii optickou (zobrazení struktur lišících se vzájemně absorpcí viditelného světla), elektronovou a akustickou.

Optická (světelná) mikroskopie

Suchý objektiv

paprsek vystupující z preparátu pod úhlem α se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu.

Imerzní objektiv

paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu, na vzniku obrazu se podílí více paprsků (obr. 8).

Imerzní prostředí

kapalina o stejném indexu lomu (n) jako krycí sklíčko, často cedrový olej (n = 1,52).

Vznik obrazu

Podstatou tvorby ostrého obrazu čočkou jsou světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku, v obrazové rovině se sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu. Vzhled obrazu u konvexních čoček závisí na vzdálenosti předmětu od čočky. Pokud je předmět vzdálený více než dvojnásobek ohniskové vzdálenosti, vzniká skutečný zmenšený a převrácený obraz (fotoaparát). Pokud leží předmět mezi dvojnásobkem ohniskové vzdálenosti a ohniskem, je vzniklý obraz převrácený, skutečný a zvětšený (objektiv mikroskopu). Pokud je předmět mezi ohniskem a čočkou, je vzniklý obraz zvětšený a neskutečný (lupa, okulár mikroskopu). Zvětšení čočky roste se zkracující se ohniskovou vzdáleností.

Fyzikální podstata vzniku obrazu v optickém mikroskopu

Ernst Abbe podal vysvětlení, které se opírá o Huygensův princip – každý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln. Zaostřená rovina preparátu je takovým objektem. Podle optických vlastností jednotlivých bodů objektu se dopadající světlo v každém z bodů transformuje (ohýbá se, láme, mění se jeho amplituda, fáze) a vznikají sekundární vlny. Ty spolu interferují, jako po průchodu světla štěrbinou nebo optickou mřížkou. Výsledné vlnění, které obsahuje informaci o vzhledu objektu, vstupuje do objektivu. V jednotlivých bodech zadní ohniskové roviny objektivu se setkávají sekundární vlny, které opustily rovinu předmětu rovnoběžně. Dochází k jejich interferenci a v souladu s Huygensovým principem se stávají zdrojem nových vln, které v obrazové rovině mikroskopu skládají zvětšený a převrácený obraz.

Základní pojmy v mikroskopii jsou zvětšení (násobek zvětšení objektivu a okuláru), kontrast a rozlišení.

Rozlišovací schopnost je vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body. Maximální rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm. Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření, u světla je to zhruba 250 nm. Rozlišovací schopnost u mikroskopu je dále omezena množstvím světelných paprsků, které mohou vstoupit do objektivu (světelnost objektivu).

Abbého zákon

n a α jsou pro daný objektiv konstanty a celý jmenovatel ve vzorci (n*sin α) se označuje jako numerická apertura objektivu (NA). Je to jedna ze základních charakteristik objektivu a její hodnota je na objektivu uvedena. Numerická apertura nejkvalitnějších imerzních objektivů je 1,3–1,4, pro suché objektivy pak max. 1. Pro nejkratší vlnové délky (400 nm) se rozlišovací schopnost mikroskopů blíží hodnotě 0,17 µm. Rozlišovací schopnost mikroskopu lze zvýšit snížením λ – použití modrého světla (modrý filtr), proudu elektronů (elektronová mikroskopie) nebo zvyšováním n – použití imerzního oleje, vody. Přidáním imerzního oleje, který má vyšší index lomu než vzduch, mezi preparát a objektiv se předchází ztrátám světla, které se láme na rozhraní preparát/prostředí. Do objektivu dopadne větší množství paprsků.

Metody zvyšující kontrast zobrazení ve světelném mikroskopu jsou:

• Zástin

  clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu. Objekty jsou osvětleny z boku a my pozorujeme pouze světlo, které se na nich láme nebo odráží. Podobného efektu dosáhneme tím, že na zdroj světla položíme minci.

• Fázový kontrast

  (obr. 9) slouží k pozorování nativního preparátu (živé nebarvené nefixované buňky). Na kondenzor se umístí maska s kruhovou štěrbinou, kterou proniká světlo do objektu. V objektivu, v místě obrazu kondenzorové masky, je umístěna fázová maska (označení objektivu Ph). V místě štěrbiny u kondenzorové masky je u fázové masky napařena polopropustná vrstva kovu, který mění fázi světla o čtvrtinu vlnové délky. Díky tomuto uspořádání prochází nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje částí fázové masky, která mění fázi světla. Ostatní vlnění, které se na objektu ohnulo nebo zlomilo, projde beze změny. Tato technika převádí rozdíly v posunu fáze světla procházejícího různými části objektu, které nevidíme, na rozdíly v intenzitě světla, které můžeme pozorovat. Lze pozorovat tvar buněk, pohyb. „Husté“ části buňky s vysokým indexem lomu jsou zářivé. Toho se využívá při pozorování endospor vně i uvnitř buněk, pokud je buňka tvoří. Pro fázový kontrast je charakteristický tzv. „haló“ efekt (zářivá korona) kolem buněk.

  

• Nomarského diferenciální interferenční kontrast

  pracuje se dvěma koherentními (interference schopnými) paprsky, jeden prochází objektem, druhý mimo objekt. Hranol dělí původně lineárně polarizované světlo na dvě vzájemně kolmo polarizované složky. Polarizátor srovnává vlny, jež jsou v různých rovinách. Nomarského destička v kondenzoru je hranol, jež zpracovává polarizované světlo tak, že na preparát jdou dva paprsky souběžně vedle sebe. V analyzátoru vidíme 3D obraz v závislosti na různém indexu lomu různých částí buňky. Zvýrazněním i malých rozdílů vznikne plastický obraz povrchu buňky (obr. 10).

  

Postup

• Zapnout zdroj světla a na stolek vsunout preparát.
• Regulátor světla a kondenzor není potřeba nastavovat.
• Objekt hledat pomocí makroposuvu a doostřit mikroposuvem.
• Postupně zvyšovat zvětšení výměnou objektivů na revolveru, objektiv nesmí narazit na sklíčko preparátu!
• Objektivy na revolveru jsou obvykle parfokální (zaostřeny na přibližně stejnou vzdálenost), po výměně objektivu není třeba objekt znovu hledat, ale stačí doostřit mikroposuvem.
• Revolverový měnič objektivů slouží pro výběr vhodného objektivu.
• Objektivy označené Ph slouží pro pozorování preparátů při fázovém kontrastu.
• Pro objektivy s černým a bílým pruhem (objektiv 100x) je vždy nutné použít imerzní olej! Pro objektivy zvětšení 10x, 20x a 40x se imerzní olej nepoužívá!
• Při použití imerzního oleje je objektiv nezbytné po skončení pozorování vyčistit směsí etanolu a etheru!

Použití imerzního oleje

• Zaostřit objekt největším neimerzním objektivem (nejčastěji 40x).
• Otočit revolver do polohy mezi tento a imerzní objektiv a na místo preparátu, které pozorujeme, kápnout kapku imerzního oleje.
• Otočit revolver na imerzní objektiv, který se musí ponořit do oleje a doostřit mikroposuvem.
• Pokud objekt není vidět, je třeba přiblížit objektiv k preparátu, nesmí do něj narazit. Zboku sledovat objektiv a stolek s preparátem.
• Následně je třeba pomalu pohybovat objektivem směrem od preparátu a pozorovat, dokud není vidět preparát v okulárech. Pokud stále není nic vidět, ostření opakujeme.

Zhodnocení cvičení

Další informace k této problematice najdete v následující literatuře

Kontrolní otázky