Základní mikrobiologický rozbor vody

Úvodní slovo

Voda je jedním z přirozených stanovišť bakterií. Jejich množství a druhové zastoupení závisí na zdrojích uhlíku a dusíku a na přítomnosti kyslíku. Množství mikroorganizmů závisí na vlastnostech prostředí (hloubka, přítomnost živočichů a rostlin, proud vody, pH, teplota, vzdálenost od břehu, atd.).

Mezi typické vodní bakterie (autochtonní vodní bakterie) patří např. Chromobacterium, Flavobacterium, Sphaerotilus, Leptothrix a Spirillum.

Pokud je ve vodě velké množství organické hmoty, více se vyskytují anaerobní nebo fakultativně anaerobní bakterie (např. Clostridium).

Splavováním půdy se do vody navíc dostávají aerobní půdní bakterie, např. Micrococcus, Streptomyces a koryneformní bakterie Corynebacterium, Brevibacterium. Vzhledem k mohutnému enzymatickému systému je jejich výskyt limitován koncentrací živin.

Krátkodobě se ve vodě mohou vyskytovat pro člověka závažnější bakteriální kontaminanty, především zástupci termotolerantních (fekálních) koliformních bakterií a intestinálních enterokoků a některé druhy rodu Clostridium. Za určitých podmínek můžeme izolovat i patogenní bakterie (např. Salmonella typhi), ale voda pro ně není vhodným stanovištěm, přežívají jen omezeně.

Cyanobakterie mají gramnegativní typ buněčné stěny a běžně se vyskytují ve vodě, půdě ale i na pouštích a v polárních oblastech. Mají schopnost fotosyntézy, buňky obsahují chlorofyl v tylakoidech a fykobilizomy (ostatní bakterie schopné fotosyntézy obsahují bakteriochlorofyl). Od ostatních prokaryot se odlišují přítomností vnějšího obalu z polysacharidů či polypeptidů (glykokalyx), plynných měchýřků a přítomností enzymu RUBISCO v karboxyzomech. Další zvláštností jsou diferencované buňky: heterocysty (fixace N₂), akinety (klidová stádia), baeocyty (reprodukční funkce). Pro masivní rozvoj ve vodě potřebují fosfor, vyšší teploty, určité pH a dostatek živin. Mohou do prostředí uvolňovat cyanotoxiny a způsobovat tzv. vodní květ. Vybraní zástupci: Spirulina, Nostoc, Anabaena, Chroococcus, Cyanobacterium, Microcystis.

Specifické prostředí pro mikroorganizmy jsou moře a oceány. Mikroorganizmy jsou součástí planktonu a účastní se koloběhu prvků, musí být tolerantní k soli, teplotě i tlaku, např. Shewanella, Vibrio, Marinobacter, Colwellia, Thiomargarita namibiensis. V hlubokomořských příkopech se vyskytují extremofilní mikroorganizmy (teplota, tlak), především z domény Archaea.

Rutinní mikrobiologický rozbor vody je složkou komplexního posouzení kvality vody a jeho provedení a vyhodnocení se řídí státní normou. Při rozboru vody nelze pro materiálovou a časovou náročnost stanovit všechny přítomné mikroorganizmy včetně patogenních. Proto se pro zjištění výskytu z hygienického hlediska závadných bakterií využívá stanovení tzv. indikátorových skupin bakterií, které mají stejný ekologický charakter a lze je rychle a jednoduše stanovit. Stanovení indikátorových skupin (koliformní bakterie, fekální koliformní bakterie, enterokoky, mezofilní bakterie, psychrofilní bakterie, bezbarví bičíkovci a další mrtvé a živé organizmy) napoví, jaké skupiny mikrobů voda obsahuje. Pitná voda nesmí obsahovat termotolerantní (fekální) koliformní bakterie a intestinální enterokoky. Termotolerantní koliformní, fermentující střevní bakterie jsou důkazem fekálního znečištění vody, což může znamenat i přítomnost patogenů. Na selektivních médiích pro stanovení indikátorů se test na využívání substrátů projeví určitým zbarvením kolonie. Indikátorová hodnota intestinálních enterokoků a fekálních koliformních bakterií není a nemůže být jednoznačná, je diskutována, zatím však nebyly jako základní organizmy hygienického hlediska uspokojivě nahrazeny.

Endo agar je selektivně diagnostické médium s bazickým fuchsinem, který eliminuje růst grampozitivních bakterií, a s laktózou jako zdrojem uhlíku. Štěpení laktózy je typické pro fermentující koliformní bakterie. Indikátorem proběhlé biochemické reakce štěpení substrátu laktózy je Schiffovo reagens, které indikuje acetaldehydy. Na Endově půdě roste většina nenáročných gramnegativních aerobních a fakultativně anaerobních bakterií. Při hodnocení se počítají kolonie laktóza pozitivních bakterií, které rostou v tmavorudých koloniích (médium zčervená), Escherichia coli většinou i s kovově zlatým leskem. Laktózu neštěpící druhy rostou v růžových až průhledných koloniích a do výpočtu se nezahrnují. Kultivace probíhá při 37 °C.

Slanetz-Bartley agar se využívá pro stanovení enterokoků. Médium obsahuje trifenyltetrazolium chlorid, který enterokoky redukují na červený formazan, kolonie s tmavě rudým pigmentem. Azid sodný slouží jako selektivní činidlo pro potlačení růstu gramnegativních bakterií. Doporučuje se kultivace při 44 °C, protože při 37 °C mohou na médiu vyrůst i streptokoky. Další konfirmační testy pro odlišení od ostatních streptokoků je např. využití antibiotik. Při hodnocení se počítají červené kolonie nebo kolonie s červeným středem a růžovými okraji; bílé a bezbarvé kolonie či malé červené kolonie (menší než 2 mm) se nepočítají.

Agar mFC obsahuje laktózu. Selektivní činidlo pro grampozitivní organizmy jsou žlučové soli. Médium obsahuje anilínovou modř, která kolonie zbarví do modra. Při hodnocení se nepočítají světle růžové a šedé kolonie. Kultivace probíhá při 44 °C.

TYEA agar obsahuje trypton, kvasničný extrakt a agar. Je to univerzální půda (neselektivní médium), která slouží pro stanovení celkového počtu mikroorganizmů (obecné znečištění vody). Při hodnocení se počítají všechny narostlé typy kolonií schopné růst za určité teploty. Kultivace probíhá při 22 °C pro psychrofilní a při 37 °C pro mezofilní mikroorganizmy.

Psychrofilní mikroorganizmy jsou bakterie s optimem růstu okolo 20 °C, které indikují přítomnost organických látek rychle rozložitelných bakteriemi při nízkých teplotách. Jejich stanovení se provádí u pitných vod, u povrchových vod především v případě využití zdroje k úpravě na vodu pitnou. Pouze jejich velmi vysoký počet znamená přítomnost mnoha organických látek ve vodě. Psychrofilní bakterie jsou přirozenými autochtony vod.

Mezofilní bakterie jsou bakterie s optimem růstu okolo 37 °C, které indikují znečištění mikroflórou teplokrevných živočichů a člověka, včetně možných patogenních mikrobů. Ve vodě je povolen pouze jejich nízký počet.

Jako koliformní bakterie se označují některé druhy gramnegativních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae, které při kultivaci na selektivně-diagnostických půdách rozkládají laktózu během 24 - 48 hodin. Typický a běžně rozšířený zástupce je druh Escherichia coli žijící převážně v trávicím traktu teplokrevných živočichů včetně člověka. Je indikátorem fekálního znečištění se schopností růstu i při teplotách 42-44 °C. Kromě E. coli patří ke koliformním termotolerantním bakteriím i druhy rodů Enterobacter, Citrobacter a Klebsiella, které se kromě trávicího traktu mohou vyskytovat i v jiných prostředích. Pro kultivaci koliformních bakterií se používá řada živných médií, většinou s obsahem laktózy. Přítomnost termotolerantních koliformních bakterií ve vodě je možným důkazem znečištění fekáliemi, tedy i případného znečištění střevními patogenními bakteriemi (Salmonella, enterotoxigenní Escherichia coli). V případě, že je podezření na přítomnost patogenů, je potřeba rozšířit základní rozbor o jejich stanovení.

Stanovení termotolerantních fekálních koliformních bakterií provedením tzv. teplotního testu potvrdí čerstvé fekální znečištění. Odliší bakterie pocházející ze staršího znečištění, které jsou již součástí heterotrofního společenstva dané lokality. Test se provádí při teplotě 44 °C na mFC médiu.

Enterokoky (např. E. faecalis, E. faecium, E. gallinarium, E. avium) jsou skupina fakultativně anaerobních grampozitivních koků, která se vyskytuje v trávicím traktu člověka a živočichů, ale i běžně v prostředí. Enterokoky, na rozdíl od ostatních streptokoků, rostou za přítomnosti chloridu sodného (6,5%), při zásaditém pH 9,6 a v rozmezí 10–45 °C. Vyznačují se relativně vyšší termorezistencí a odolností vůči dalším fyzikálním a chemickým vlivům okolního prostředí. Pouze intestinální enterokoky (E. faecalis, E. faecium) jsou považovány za významný indikátor čerstvého fekálního znečištění, především ve vodách pitných, upravovaných dezinfekcí.

Pravidla odběru vzorku před jeho kultivací - mikrobiologické rozbory

Nádoby na vzorky musí být z průhledného a nezabarveného materiálu (sklo, polyetylen, polypropylen). Nádoby na vzorky musí být sterilizovány v autoklávu při 121 °C po dobu nejméně 15 minut (sklo, polypropylen), projít suchou sterilizací při 160 °C až 170 °C po dobu nejméně 1 hodiny (sklo) nebo musí být deklarované jako sterilní přímo od výrobce. Při odběru vzorku musí být dodržena aseptická práce. Vzorky je nutno chránit během celé přepravy před vystavením světlu, zejména přímému slunečnímu záření. Vzorek je třeba až do příjezdu do laboratoře uchovávat v chladicím boxu nebo chladničce (podle klimatických podmínek) při teplotě okolo 4 °C. Potrvá-li přeprava do laboratoře déle než 4 hodiny, je nutná přeprava v chladničce. Doba mezi odběrem vzorku a provedením rozboru musí být co nejkratší, ideálně do 24 hodin při uchování vzorku v temnu při teplotě 4 °C ± 3 °C. Dojde-li k prodlení mezi odběrem vzorků a provedením rozboru, upraví se naměřená koncentrace bakterií podle známých vzorců rozkladu, aby byla stanovena koncentrace bakterií v okamžiku odběru.

Pitná voda

Problematiku pitných vod řeší vyhláška 252/2004 Sb. Posouzení kvality pitné vody se provádí rozbory 2 typů. Při kráceném rozboru jsou měřeny pouze některé chemické a mikrobiologické parametry. Většinou je vyžadován příslušným úřadem u kolaudací studen soukromých osob. V lokalitách, kde se nachází např. uran, arsen, antimon a další prvky, jejichž kvalitu je potřeba rovněž sledovat, je rozbor nutno rozšířit i o geologické souvislosti. Majitelé studní by si měli pravidelně nechávat provádět laboratorní rozbory pitné vody, které provádějí zdravotní ústavy i některé akreditované soukromé firmy. Zkrácený rozbor, který přijde řádově asi na 1500 - 3000 Kč, obsahuje vyšetření na mikroby, barvu, zákal, chemickou spotřebu kyslíku a velice omezené množství chemických látek. Zkoumají se látky obsahující dusík, tj. dusičnany, dusitany a amoniak. Kompletní rozbor vody, který je měřen dle celého rozsahu vyhlášky 252/2004 Sb. je požadován zdravotními ústavy u provozovatelů veřejných vodovodů, u podniků veřejného stravování, hotelů atd. s vlastním zdrojem pitné vody. Četnost rozborů určuje příslušný zdravotní ústav. Od roku 2004 se všechna data z měření vodovodů a také z bazénů, veřejných koupališť apod. zasílají do databáze pitných vod tzv. PiVo Ministerstva zdravotnictví ČR.

Povrchová voda

Sledování kvality vod ve vodních tocích a nádržích spravují jednotlivá povodí - Povodí Labe, Vltavy, Odry, Ohře a Moravy. Další měření provádí Český hydrometeorologický ústav, Výzkumný ústav vodohospodářský TGM a Státní meliorační správa. Jakost vod se významně zlepšila především díky výstavbě nových čistíren odpadních vod, omezením používání hnojiv v zemědělství a omezováním průmyslových výrob. Problémem zůstává mikrobiální znečištění, které pochází především z komunálních zdrojů znečištění. Nárůst počtu bakterií způsobený vypouštěním komunálních odpadních vod je příčinou, proč velké vodní toky většinou nejsou vhodné ke koupání. Mikrobiologické parametry nejsou při rozborech odpadních vod platnou legislativou vyžadovány (Nařízení vlády 61/2003). Samotné sledování vzniklou situaci neřeší a možností, jak snížit stupeň mikrobiálního znečištění odpadních vod je jejich dezinfekce, která je problematická z hlediska technologií a také finančně náročná.

Odpadní vody

Velmi obecně lze říci, že odpadní vody jsou vody, které mají po použití změněnou jakost. U průmyslových odpadních vod jsou dány emisní limity pro jejich vypouštění, hodnoty průměrné a hodnoty maximální, tj. nepřekročitelné hodnoty, které stanovuje vodoprávní úřad. Analýza odpadních vod je prováděna v akreditovaných laboratořích periodicky na základě rozhodnutí příslušného úřadu. Pro některé typy odpadních vod bývá nařízen i tzv. 2hodinový, nebo i 24hodinový odběr, aby se zajistila průměrná hodnota měnících se parametrů v těchto vodách.

Seznam přístrojů, materiálu a mikroorganizmů

• TYEA (trypton, yeast extract, agar)
• Slanetz-Bartley (SB) agar, Endo agar, mFC agar
• Fyziologický roztok, pipety, hokejky, zkumavky
• Vzorek vody (pitná/povrchová voda)

Postup

Pitná voda – neočekáváme znečištění, používat neředěný vzorek a ředění 10^-1.

Povrchová voda – očekáváme znečištění, používat ředění 10^-1 a 10^-2.

V protokolu vždy uvést zdroj vody!

Každé ředění očkovat na min. 2 misky pro vytvoření aritmetického průměru (obr. 50).

Postup ve cvičení vychází z normy ČSN 830521; v dnešní době je však platný postup dle Vyhlášky č. 252/2004 Sb. (modifikace použitých médií k záchytu daných bakteriálních druhů; upravená média pro jiné indikátorové skupiny bakterií po filtraci vody).

Obecné znečištění

• Vzorek vody naředit na koncentraci 10^-1, případně 10^-2 dle typu vzorku (0,5 ml vzorku do 4,5 ml fyziologického roztoku).
• Vzorek dobře promíchat a 1 ml každého ředění pipetovat do sterilních Petriho misek.
• Přelít zhruba 15 ml temperovaného TYEA média.
• Kultivace probíhá při 22 (psychrofilové) a 37 °C (mezofilové).
• Celkem je potřeba 8 misek pro jeden vzorek (2 ředění po 2 miskách a teploty kultivace 22 a 37 °C).

Stanovení indikátorů kultivací na selektivně diagnostických médiích

• Vzorek vody naředit na koncentraci 10^-1, případně 10^-2 dle typu vzorku (0,5 ml vzorku do 4,5 ml fyziologického roztoku).
• Vzorek dobře promíchat a 0,1 ml vzorku každého ředění pipetovat na připravené agary v Petriho miskách (SB, ENDO a mFC agar) a rozetřít bakteriologickou L-kličkou.
• Kultivace probíhá při 37 (ENDO agar) a při 44 °C (SB a mFC agar).
• Při stanovení enterokoků z pitné vody (SB agar) je možné koncentrovat vzorek pomocí filtrace vzorku před kultivací.

Zhodnocení cvičení

Na TYEA agaru počítat všechny typy narostlých kolonií (obr. 51).

Na Endo agaru (obr. 52) počítat kovově lesklé kolonie E. coli, tmavě červené kolonie ostatních koliformních bakterií. Růžové či průhledné kolonie značí laktóza negativní bakteriální izoláty, nepočítají se.

Na SB agaru (obr. 53) počítat temně červené kolonie či kolonie s červeným středem a růžovým okrajem = presumptivní intestinální enterokoky.

Na mFC agaru (obr. 54) počítat fialové až tmavomodré laktóza pozitivní kolonie, nepočítat světle růžové a šedé kolonie.

Pro posouzení výsledků je nutné výsledky přepočítat na CFU/ml v původním vzorku. K hodnocení vybrat dvojici misek vhodného ředění (misky se zhruba 20 - 200 koloniemi) a spočítat počet kolonií. Kolonie počítat ze dna misky a označit fixou na sklo tečkou. Ze získaných hodnot vypočítat průměr, číslo vynásobit kladnou hodnotou ředění. V případě nanášení 0,1 ml vzorku na misku (selektivní média) navíc hodnotou 10 (přepočet na 1 ml). Výsledky porovnat s tabulkami hodnot pro rozbor vody Vyhlášky č. 252/2004 Sb. (obr. 55).

Další informace k této problematice najdete v následující literatuře

Kontrolní otázky

Vyzkoušejte se