Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce

Úvodní slovo

Zásady přípravy mikrobiologických půd

Nutno pracovat se sterilním nádobím ve sterilním prostředí, co nejrychleji na úkor objemové přesnosti (tzv. aseptická práce). Ožehávat hrdla baněk i zkumavek. Při práci nemluvit. Nádoby s již sterilním médiem otevírat co nejméně.

Kultivace

Kultivace mikrobů je základním postupem sloužícím k jejich přímému průkazu. Charakter růstu bakterie je důležitým identifikačním znakem; nevýhodou je doba kultivace (např. Mycobacterium tuberculosis roste 9 týdnů, většina bakterií pouze 24–48 hodin). Mikroorganizmy (bakterie, vláknité houby, kvasinky) se v mikrobiologických laboratořích kultivují na sterilních živných médiích, které splňují všechny požadavky na výživu a mají optimální pH, osmotické poměry a redoxpotenciál. Samozřejmostí je dostatek vody pro životní pochody a přítomnost živin: zdroje energie (organotrof – organická látka; fototrof – světlo; litotrof – anorganická látka), uhlíku (heterotrof – organická látka; autotrof – CO₂), dusíku (amonné ionty, dusičnanové ionty, aminokyseliny, bílkoviny nebo jejich částečné hydrolyzáty) a biogenních prvků (anorganické soli), přičemž hodnoty uvedených podmínek musí zůstat optimální po celou dobu kultivace.

Živná média

Dle složení lze média dělit do dvou základních skupin: média syntetická (definovaná) s přesně definovaným složením (ústojné roztoky, zdrojem uhlíku obvykle glukóza, zdrojem dusíku (NH₄)₂SO₄ nebo NH₄Cl, čisté aminokyseliny, vitamíny a růstové faktory) a média přirozená (komplexní), které mají ve svém základu živný bujón a nejsou chemicky definované. Jsou tvořeny složkami získanými po kyselé hydrolýze kaseinu, želatiny nebo po enzymatické hydrolýze masa (pepsin, trypsin, pankreatin).

Podle konzistence rozeznáváme média tekutá (mléko, masopeptonový bujón, cukrová média, sladina), polotekutá, ztužená a tuhá. Výhodou tekutých médií je snadný přístup vody a živin, mikroorganizmy v nich snáze rostou. Nevýhodou je růst mikroorganizmů projevující se zakalením, sedimentem nebo blankou (dle nároků na kyslík). V tekutém médiu nelze určit, zda se jedná o čistou kulturu nebo směs více druhů, rodů.

Pro přípravu ztužených půd se k bujónovému základu přidává většinou agar (směs polysacharidů z mořských řas, není využíván jako zdroj živin), méně pak želatina (nižší teplota tání, okolo 35 °C) či křemičité gely. Výhodou kultivace na pevném médiu na Petriho misce je možnost pozorování izolovaných kolonií (klonů jedné buňky), tedy izolovaných kmenů. Kolonie bakteriálního druhu je taxonomicky významný makroskopický znak.

Média univerzální svým složením vyhovují požadavkům na výživu širokého spektra organizmů (např. masopeptonový bujón, sladinový agar). Média selektivní svým složením zvýhodňují růst jednoho druhu nebo cílové skupiny organizmů, růst ostatních druhů je inhibován (např. Ashbyho agar – bezdusíkaté médium, rostou na něm jen organizmy schopné fixace vzdušného dusíku). Selektivní média obsahují inhibiční složku nebo naopak některá základní složka chybí, což zvýhodňuje a cíleně izoluje prokazované rody a druhy. Média selektivně diagnostická svým složením potlačují růst většiny mikroorganizmů a umožňují růst jen velmi malé skupině. Charakteristický růst se projeví změnou barvy média či kolonií vlivem vlivem indikátorové složky média (např. Endova půda).

Příklady kultivačních půd

• Masopeptonový agar (MPA)

  obsahuje výtažek z masa, pepton, sůl a agar, bývá základem pro další média.

• Krevní agar (KA)

  připravuje se přidáním 5–10% defibrinované zvířecí krve k vhodnému základu (např. MPA), nejvíce používaná půda, roste na ní většina bakterií, na KA lze odečítat hemolýzu, pokud bakterie tvoří hemolyziny – vznik úplného projasnění, u neúplné hemolýzy není projasnění úplné.

• Endova půda (Endoagar, EA)

  selektivně diagnostická půda pro střevní bakterie (čeleď Enterobacteriaceae), obsahuje laktózu. Indikátorem jejího kvašení je bazický fuchsin odbarvený siřičitanem sodným. Je-li laktóza kvašena, mění se barva světle fialovočervená do temné fialové (detekce aldehydů Schiffovým činidlem). Bakterie, které kvasí laktózu, mají tmavě fialově zabarvené kolonie. Bakterie, které laktózu nezkvašují, mají kolonie růžové.

• XLD agar

  půda pro záchyt patogenních střevních bakterií (Salmonella), obsahuje xylózu. Xylózu kvasící bakterie jsou žluté. Lze rozpoznat tvorbu H₂S – černý střed kolonií.

• Sabouraudova půda

  pro záchyt kvasinek a plísní, obsahuje glukózu nebo maltózu, pH 5,0.

• Fortnerova půda

  pro záchyt anaerobů (obsahuje redukující substance).

• Löwenstein-Jensenova půda

  pevná půda pro záchyt mykobakterií, obsahuje vaječnou emulzi, glycerin, škrob, malachitovou zeleň.

• Slanetz-Bartley agar (SB)

  selektivně diagnostická půda pro bakterie rodu Enterococcus, chudá na živiny (enterokoky jsou nenáročné oproti jiným bakteriím), kolonie enterokoků mají v masivním nárůstu fialovohnědou barvu.

• Wilson-Blairova půda

  selektivní půda určena k detekci S. typhi (černě kovově lesklé kolonie s černým okolím).

• Claubergova půda

  diagnostická půda pro Corynebacterium diphtheriae (černé kolonie s kovovým leskem).

• Čokoládový agar

  obsahuje krev přidávanou do horkého základu pro krevní agar (80°C), slouží ke kultivaci náročných mikrobů, jelikož se tepelnou lýzou z krvinek uvolní některé růstové faktory.

• Mueller-Hinton agar

  využívá se pro testování citlivosti a rezistence k antibiotikům a pro primární izolaci neisserií.

Uchování médií

Až na výjimky se média uchovávají v lednici tak, aby nevysychaly – dnem vzhůru a zabalené a to po stanovenou dobu exspirace. Čerstvá média nesmí mít před očkováním bakterií mokrý povrch – před začátkem práce se dávají na několik hodin sušit.

Dezinfekce, sterilizace, dekontaminace

Odstranění mikroorganizmů z prostředí (dekontaminace) může být zabezpečeno různými způsoby a tomu odpovídá též dosažený efekt. Prostý úklid, mytí, praní a žehlení snižuje výskyt mikroorganizmů až o 90%. Tím se zvyšuje účinnost následně prováděné dezinfekce nebo sterilizace.

Dezinfekce

s použitím chemických látek nebo fyzikální je definována jako ničení či zneškodňování vegetativních buněk patogenních mikroorganizmů na neživých předmětech, ve vnějším prostředí (ve vodě, ve vzduchu apod.) a v infekčním materiálu. Cílem dezinfekce je učinit předměty (zevní prostředí) neinfekční. Účinnost dezinfekce je závislá na rezistenci mikroorganizmů vůči těmto prostředkům, které by měly mít baktericidní účinek na většinu patogenních mikroorganizmů.

Antisepse

je zneškodňování patogenních agens v prostředí živých tkání, v ranách, na sliznicích a na kůži s použitím antiseptik. Je namířena hlavně proti mikrobům vyvolávajícím hnisání. U antiseptik není striktní požadavek na baktericidní účinek jako u dezinfekčních prostředků, stačí bakteriostatické působení. Antiseptika musí splňovat požadavek nejedovatosti a dobré snášenlivosti živými tkáněmi. Na rozdíl od dezinfekčních prostředků proto podléhají schválení jako každý jiný zdravotnický prostředek. U antiseptik není nutná dobrá rozpustnost ve vodě.

Asepse

je souhrn opatření vedoucích ke stavu, kdy je v prostředí minimum mikroorganizmů. Asepse má zabránit přístupu mikroorganizmů k živým tkáním při chirurgických operacích používáním sterilních nástrojů, obvazových látek, šicího materiálu, pryžových rukavic, přípravou operačního pole, dezinfekcí chirurgových rukou, používáním ústenek apod. Pojem asepse zahrnuje také laboratorní a výrobní metody, u nichž je snaha zabránit mikrobiální kontaminaci např. u mikrobiologických laboratorních prací a při výrobě léků.

Sterilizace

je zničení všech živých mikroorganizmů, včetně vysoce rezistentních bakteriálních endospor fyzikálními nebo chemickými postupy.

Sterilizace nasycenou vodní parou pod tlakem

(v autoklávu) se provádí nejčastěji za přetlaku 100 kPa při teplotě 121 °C po dobu 15–30 minut. Tento způsob sterilizace umožňuje zničit bezpečně všechny formy mikroorganizmů. Autokláv je tlakový sterilizátor opatřený vodoznakem pro stav vody ve vyvíječi páry (pokud není přímo napojen na přívod páry z centrálního zdroje). Dále je vybaven pojistným ventilem, dvěma manometry (jeden k měření přetlaku páry ve vyvíječi, druhý v pracovním prostoru), odvzdušňovacím ventilem, vodní vývěvou a teploměrem. Dokonalé odvzdušnění pracovního prostoru na začátku sterilizace je předpokladem úspěšné sterilizace (směs páry se vzduchem při 121 °C a 30 minutové expozici nemá spolehlivý sterilizační efekt). V autoklávu lze sterilizovat různé roztoky, kovové laboratorní nástroje, pryžový materiál. Při sterilizaci bakteriologických půd je třeba dát pozor na možnost hydrolýzy disacharidů a poškození termolabilních látek.

Seznam přístrojů, materiálu a mikroorganizmů

• komerční masopeptonové médium (MPB – meat pepton broth)

• agar, destilovaná voda

• sterilní Petriho misky

• skleněné zkumavky, Erlenmeyerovy baňky

• vatové zátky, odměrný válec, autokláv

Postup

• Práce probíhá ve dvojici. Popsat své zkumavky a misky zespodu.

• Do Erlenmeyerovy baňky navážit 2,6 g sušeného základu pro masopeptonový bujón.

• Doplnit do 200 ml destilovanou vodou, důkladně rozmíchat a změřit pH (pH papírkem, případně upravit).

• Pipetovat po 5 ml do dvou zkumavek, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Takto jsou zkumavky s bujónem připravené ke sterilizaci.

• Ke zbytku roztoku média přidat 3,6 g agaru a promíchat. Médium zahřívat do rozvaření agaru (v autoklávu či mikrovlnné troubě), poté pipetovat opět do dvou zkumavek po 5 ml, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Zkumavky jsou připravené pro sterilizaci ‑ šikmý agar.

• Zbytek média v baňce uzavřít vatovou zátkou a společně se zkumavkami umístit do autoklávu. Sterilizace probíhá 20 min při tlaku 0,15 MPa a teplotě 121 °C.

• Po sterilizaci v autoklávu je již médium sterilní, nutno dodržovat zásady aseptické práce (ožehnout hrdla baněk a zkumavek)!

• Sterilní médium z baňky rozlévat do předem připravených sterilních Petriho misek. Do misky nalít zhruba 20 ml média, to odpovídá 4–5 mm média na výšku v misce. Misky otevírat co nejméně, při práci nemluvit (obr. 1A). Po utuhnutí misky obrátit dnem vzhůru.

• Zkumavky se sterilním agarem ještě za tekutého stavu uložit do šikmé polohy a nechat ztuhnout (obr. 1B).

• Po několika dnech vyhodnotit, zda nedošlo ke kontaminaci.

Zhodnocení cvičení

Další informace k této problematice najdete v následující literatuře

Kontrolní otázky

Zajímavosti

Robert Koch zavedl kultivaci na extraktu z hovězího masa zpevněném želatinou. Kultivací na pevné půdě tak mohl zjistit počet druhů bakterií (dle vzhledu kolonie) a počet buněk ve vzorku (= počet kolonií) a získat čistou kulturu.

Walter Hesse na radu své manželky nahradil želatinu agarem.

Petriho misky byly v mikrobiologii zavedeny Richardem Petrim v roce 1887.

Masový výtažek je bohatý na růstové faktory, ale na živiny je poměrně chudý. Frederick Loeffler (spoluobjevitel původce záškrtu) vylepšil masový extrakt přídavkem peptonu (produkt enzymatického natrávení masa, obsahuje peptidy i volné aminokyseliny) a NaCl, tím vznikl živný bujón.

Komerční sušená kultivační média se používají od roku 1914.